ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Використання в генній інженерії рослин Т-ДНК

Для використанні в генній інженерії рослин Т-ДНК вирізають з Ті-плазміди  за допомогою рестриктаз та  вбудовують  в один зі стандартних плазмідних векторів для розмноження в клітинах E. coli -  плазміду E. coli рВR322, здатну до автономної реплікації, яка забезпечує клонування сегменту Т-ДНК.  Бактерії, які містять плазміду рВR322 з ділянкою Т-ДНК, розмножують, після чого цю плазміду виділяють.  Потім за певною методикою, з використанням рестриктаз у Т-сегмент вбудовують цільовий ген. Отриманий молекулярний гібрид знову розмножують в клітинах кишкової палички, а потім вводять у клітини агробактерії, яка несе відповідну повну Ті-плазміду.  В результаті  гомологічної рекомбінації  між Т-сегментами  нативної і сконструйованої Ті-плазміди  Т-ДНК з вбудованим стороннім геном  включається  в Ті-плазміду, заміщуючи нормальну  Т-ДНК.  Таким чином, отримують  клітини A. tumefaciens, які несуть Ті-плазміду з вбудованим у Т-ДНК цільовим геном.  Далі рослинні тканини або ізольовані клітини  інфікують цими  генетично-модифікованими агробактеріями шляхом кокультивування (спільного культивування на живильному середовищі).  Агробактерії передають у рослинний геном Т-ДНК з вбудованим цільовим геном,  і рослинні клітини, тканини і регенеровані з них  цілісні рослини стають генетично модифікованими. vukorustanya_T-rnk

Для спрощення наведеної вище процедури запропоновано використовувати так звані бінарні вектори. Для цього  клітина агробактерії повинна містити  як найменше дві  різні модифіковані Ті-плазміди.  Одна з них, плазміда-помічник,  повинна  містити тільки  Vir-район, гени якого будуть приймати участь у вирізанні Т-ДНК.  Інша Ті-плазміда повинна  містити   сегмент Т-ДНК  з вбудованим цільовим геном.  Продукти vir-генів  здатні вирізати Т-ДНК як на власній плазміді, так і на сусідній, тобто vir-гени можуть працювати незалежно від  їх місцерозташування.  Таким чином, якщо агробактерії містять Ті плазміду з  областю Vir   та  іншу плазміду  з Т-ДНК,  до якої вбудований цільовий ген, ці бактерії будуть трансформувати клітини рослин.

Векторна система на основі Ті-плазміди повинна  містити усі сигнали, необхідні для транспорту та стабільної інтеграції у ядерну ДНК рослин, систему для експресії сторонніх генів в рослинах, зокрема,  промотор, який буде розпізнаватися рослинними ДНК-залежними РНК-полімеразами, маркерний ген,  необхідний для селекції трансформованих клітин. Ця система також не повинна містити онкогенів, які  пригнічують диференціацію.  Інактивація онкогенів виконується за допомогою транспозонового мутагенезу. Так, в результаті введення транспозона (послідовності ДНК, яка здатна переміщуватися  по геному) в Т-ДНК можливо виключити гени, які викликають пухлино утворення.   Зазвичай використовують бактеріальні транспозони Tn5 та Tn7.  В процесі  підготовки Ті-плазміди  треба передбачити також   наявність унікальних сайтів рестрикції для вбудовування  стороннього фрагменту ДНК. Такі  унікальні сайти   створюються включенням в штучні Ті-конструкції послідовностей з  численними сайтами рестрикції для рестриктаз EcoR1, HindIII, BamH1та інших.  В деяких випадках  множинний сайт  є полілінкером, оскільки має до 20   сайтів рестрикції для різних рестриктаз.

Дуже важливо при конструюванні векторів на основі Ті-плазмід підібрати такі промотори, які  забезпечать експресію трансгена в рослинах. Для цього промотор повинен  бути сильним, тобто забезпечувати активну експресію, бути  здатним до регуляції, забезпечувати   тканино- та органоспецифічну експресію.  Найбільш популярним у сучасній генетичній інженерії рослин є  промотор гена вірусу мозаїки кольорової капусти (CAMV).

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.