ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Види плазмідів

Плазмідні вектори. Плазміди – це невеликі дволанцюгові молекули ДНК (1-200 тис.п.н. – 1-3% клітинного геному), які оснують позахромосомно та здатні до довготривалого автономного  існування. У генетичній інженерії, зазвичай, використовують бактеріальні плазміди. Плазміди бактерій мають кільцеву форму  і представляють собою один реплікон.  Як вектори використовують плазміди, які несуть гени стійкості до лікарських препаратів. Ці гени забезпечують можливість проведення селекції клітин, трансформованих плазмідами: клітини, які залишаються живими після дії селективного фактора, наприклад, після обробки лікарськими препаратами, повинні нести плазмідні вектори зі вставкою донорної ДНК.Plasmidu Плазміди бактерій становлять дуже ефективний засіб ампліфікації фрагмента донорної ДНК, так як вони присутні у клітині у великій кількості копій (інколи до декількох сотень). Плазмідні вектори підходять для клонування вставок донорної ДНК розміром 25-30 тис.п.н. Однією з перших плазмід, застосованих у якості багатоцільового вектора для клонування  Ф. Боліваром  із спів. у 1977 році, була плазміда E.coli pBR322.  Вона вміщує декілька зручних сайтів рестрикції, а також гени стійкості до ампіциліну та тетрацикліну. Наявність такої пари генів дозволяє одночасно ідентифікувати  бактерію – носія плазміди та відрізняти химерну плазміду  від батьківської.

Для клонування у клітинах  E.coli можуть використовуватися наступні плазмідні вектори.

Плазміда pSC101.   Ця плазміда має розмір 9,1 тис.п.н., малокопійна та містить ген стійкості до тетрацикліну.     Плазміда та її похідні використовуються   для клонування  генів, продукти яких   у великій кількості  призводять до серйозних порушень нормального клітинного метаболізму.

Плазміда ColE1 є мультикопійною. Бактеріальні клітини,  трансформовані  цією плазмідою, пізнають за стійкістю до коліцину, обумовленою геном imm, а клони з рекомбінантною ДНК відрізняють за відсутністю в них синтезу коліцину.

      Плазміда  pBR322 містить 4361 п.н.  та широко використовується у лабораторній практиці.  Він містить реплікатор плазміди pMB1 (споріднена до плазміди ColE1 та несумісна з нею), від неї має ознаку багатокопійності (15-20 копій на клітину) та здатність до ампліфікації в присутності хлорамфеніколу. Дана плазміда володіє стійкістю до  тетрацикліну та ампіциліну. На основі даної плазміди сконструйовано багато похідних векторів  для експресії генів і секреції білків, прямої селекції рекомбінантних ДНК, ідентифікації регуляторних сигналів та ін.

Плазмідні вектори серії  pUC  призначені  для клонування та експресії генів, їх копійність сягає 500 на клітину. Селективною ознакою для   відмінності вектора від рекомбінантної ДНК служить Lac-фенотип реципієнтних клітин.

Плазміда P15A   виділена зі штаму E.coli 15, відноситься до  ColE1 – типу репліконів, але сумісна з іншими плазмідами цього типу. Це дозволяє використовувати її для спільної трансформації з іншими плазмідами, наприклад, з плазмідою pBR322.  Системи з двох векторів зручні для регуляції експресії гена, що клонується, оскільки дозволяє розташувати структурний та регуляторний гени на різних плазмідах. Сама плазміда P15A не  додає клітинам певного фенотипу, тому при конструюванні векторів до її реплікатора приєднують фрагменти ДНК, які містять селективні маркери.

Вектори pGEM. Згадані вище вектори придатні лише для клонування генів в клітинах E.coli та  інших грамнегативних бактерій.  Вони є універсальними і їх використовують для різнорідних цілей. У той же час сконструйовано багато спеціальних векторів, придатних, наприклад, тільки для ідентифікації регуляторних сигналів, для суперпродукції чужорідних білків та їх секреції, для секвенування ДНК, експресії генів тварин в бактеріях.  Сучасні вектори, які пропонуються фірмами, мають деякі особливості, зокрема, містять полілінкери, причому для зручності  використання їх  вводять у протилежних напрямках.  Тобто, вектори випускають парними, що відображається на  порядковому номері при їх назві.  У векторів на кінцях полілінкерів  містяться промотори  фагів SP6, Т3 та/або Т7. Це дозволяє здійснювати транскрипцію клонованого гена in vitro в обох напрямах  з метою використання транскриптів у якості  гібридизаційних зондів або для транслювання в білок-синтезуючій системі. Прикладами саме таких векторів слугують вектори pGEM2 і pGEM2.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.