ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Вибір та отримання фрагменту донорної ДНК

Як донорну при одержанні рекомбінантних ДНК використовують такі її типи як геномна ДНК, комплементарна ДНК та хімічно-синтезована ДНК.

Геномна ДНК – це ДНК, яку одержують з хромосом організму-донора. Оскільки геномна ДНК має великі розміри, перед подальшим використанням вона має бути розрізана на фрагменти, серед яких необхідно ідентифікувати потрібний ген. Розрізання геномної ДНК проводять за допомогою бактеріальних ферментів рестрикції (рестриктаз), які розщеплюють зв’язки між нуклеотидами ДНК у специфічних місцях – сайтах рестрикції. Рестриктаза розрізає ДНК на набір фрагментів рестрикції (рестриктів), які визначаються розташуванням сайтів рестрикції. В генетичній інженерії найчастіше використовують рестриктази, які утворюють на ДНК-фрагментах так звані “липкі кінці”, тобто кінцеві ділянки ДНК, складені тільки з одного ланцюга. genetyka-95Вони несуть неспарені нуклеотиди і можуть утворювати пари з комплементарною послідовністю нуклеотидів, “злипатися”. Прикладом рестриктази, яка утворює “липкі кінці”, може служити рестриктаза EcoRI, яка пізнає на ДНК будь-якого організму паліндромну послідовність:
5?-NNNGAATTCNNN-3?
3?-NNNCTTAAGNNN-5?, де N – нуклеотид,
і розрізає її тільки у специфічних для цієї рестриктази і цієї послідовності сайтах рестрикції – між нуклеотидами G і A кожної нитки паліндрому, тобто у місцях, які зображені стрілками:
5?-NNNG?AATTCNNN-3?
3?-NNNCTTAA?GNNN-5?.
Таким чином, після дії цієї рестриктази утворюються фрагменти з липкими кінцями (виділені жирним шрифтом):
5?-NNNG-3? 5?-AATTCNNN-3?
3?-NNNCTTAA-5? 3?-GNNN-5?.
Такі фрагменти можуть бути гібридизовані з іншими фрагментами, які мають такі ж липкі кінці. Одноланцюгове спарювання такого типу інколи називають гібридизацією. В результаті такої гібридизації між донорною та векторною (або між будь-якими іншими фрагментами ДНК) утворюється рекомбінантна ДНК.

Навіть, якщо ДНК була оброблена рестриктазою, яка утворює фрагменти не з липкими, а із “сліпими кінцями”, тобто без неспарених нуклеотидів, такі фрагменти можуть бути включені у процес гібридизації за участю ферментів, що здатні з’єднувати сліпі кінці, або ферментів, що здатні перетворити сліпі кінці на короткі липкі.

Взагалі, рестриктази відносяться до групи специфічних ендонуклеаз, які впізнають на двоспіральній ДНК певні, немодифіковані метильними групами нуклеотидні послідовності (сайти впізнавання) і розщеплюють зв’язки між певними послідовностями нуклеотидів (у сайтах розщеплення). Перша рестриктаза була виділена в 1968 році Мезельсоном і Юанем. На сьогоднішній день описано близько 2500 рестриктаз, виділених з різних мікроорганізмів. Рестриктази разом з ферментами метилазами у бактерій забезпечують функціонування системи рестрикції-модифікації. Метилази сайт-специфічно метилюють власні ДНК клітин під час їх реплікації, захищаючи від пошкодження власними рестриктазами. Рестриктази не пошкоджують власні, захищені метильними групами ДНК, але розрізають чужорідні ДНК, неметильовані у відповідних сайтах. Молекулярний механізм дії метилаз системи рестрикції-модифікації полягає у перенесенні метильних груп з S-аденозил-L-метіоніну на певні залишки цитозину (з утворенням 5-метилцитозину) або аденіну (з утворенням N6-метиладеніну), розташовані симетрично на кожному ланцюгу сайту впізнавання, якщо сайти представлені паліндромами. В результаті однойменні рестриктази перестають зв’язуватися з модифікованими сайтами та розщеплювати їх. Таким чином, біологічне значення рестриктазно-метилазних систем полягає у тому, що вони обмежують горизонтальне перенесення ДНК між видами і у такий спосіб підвищують стабільність геномів у мікроорганізмів.

У 1973 році американські дослідники X. Сміт і Д. Натанс запропонували номенклатуру для позначення ферментів системи рестрикції-модифікації, яка сьогодні є загальноприйнятою. У відповідності до цієї номенклатури, перша буква роду і дві перші букви виду бактерій, з яких виділили фермент, утворюють скорочену назву ферменту. Ендонуклеази позначають символом R, метилази – М. Якщо з клітин одного виду мікроорганізмів виділено два чи більше ферментів рестрикції, то їх нумерують відповідно римськими цифрами. Виходячи з цієї номенклатури рестриктази Е. соli позначають EcoRІ, EcoRII і т. д. Три різні рестриктази Haemophilus aegyptius позначаються HaeI, HaeII і HaeIII. Білки системи рестрикції-модифікації можуть кодуватися плазмідами і фагами, и тоді до назви ферменту додається назва позахромосомного елемента. Наприклад, назва EcoP1 відноситься до ферменту, який кодується фагом P1.

Як і всі ДНКази, рестриктази активні тільки в присутності іонів магнію. Для дії кожної з них в експериментальних дослідженнях підібрані оптимальні умови, головні з яких температура та склад буфера. Однак, задля зручності у роботі (але за рахунок падіння активності ферментів у 2-3 рази) склад буфера для більшості рестриктаз вдалося уніфікувати (10мМ Tris-HCl pH 7.5, 10 мM MgCl2 та 1 мМ дитіотрейтол), залишивши варіюючою величиною тільки іонну силу (концентрацію іонів натрію) реакційної суміші. За цим параметром ферменти розділені на чотири групи: активні при низькій (0 мМ NaCl), середній (50 мМ NaCl) і високій (100 або 150 мМ NaCl) іонній силі. Багато рестриктаз здатні працювати в середовищах з різною іонною силою. Ці властивості ферментів враховуються при плануванні експериментів з розщеплення ДНК одночасно або послідовно декількома рестриктазами. Оптимальна температура дії для більшості рестриктаз – 370С. Але, наприклад, SmaI активна при 250С, а рестриктази, виділені з термофільних бактерій (BstBI, TaqI та ін.), ефективні при 650С. Останні при 370С зберігають лише 10% своєї активності.

Типовий ферментативний гідроліз ДНК проводиться в об’ємі 20 мкл з використанням 0,1-1 мкг ДНК і 1 од. ферменту (кількість рестриктази, необхідна для повного розщеплення 1 мкг ДНК фага ? за 1 годину за рекомендованих умов). Коли розщеплення ДНК ведуть двома або більшою кількістю рестриктаз, то їх додають одночасно за умови, що вони працюють в однакових буферах. В протилежному випадку першим використовують фермент, який потребує меншої іонної сили. Після закінчення заданого терміну його дії іонну силу середовища підвищують і додають другий фермент. За необхідності реакцію зупиняють додаванням 0,5 М EDTA (pH 7.5) до кінцевої концентрації 10 мМ.

За основними властивостями, до яких входять кількість субодиниць, потреба у кофакторах, специфічність сайтів розщеплення та їх положення відносно сайтів впізнавання, рестриктази поділяють на чотири класи. Для роботи всіх рестриктаз характерною є потреба в іонах Mg2+, а для роботи ферментів класів I, II i III, окрім того, обов’язковою є присутність у середовищі АТФ та S-аденозилметіоніну.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.