ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Рестриктази

Рестриктази класу I     мають складну субодиничну структуру та володіють двома типами активностей – модифікуючою (метилюючою) та АТФ-залежною ендонуклеазною. Ферменти цього класу   розщеплюють  ДНК у довільних місцях на відстані від декількох сотень до декількох тисяч пар нуклеотидів від сайтів впізнавання і утворюють при цьому суцільний спектр  фрагментів рестрикції. Оскільки за допомогою цього класу рестриктаз неможливо отримати фрагменти ДНК, строго детерміновані за розміром та вмістом інформації, рестриктази класу I практично не використовуються у генетичній інженерії для отримання рекомбінантних ДНК. restrictase  Для біотехнології важливе значення мають   рестриктазно-метилазні системи   класу I   E.coli, оскільки клітини цього виду (зокрема штаму   К-12) використовуються для тестування чужорідної ДНК. Рестриктази і метилази E.coli класу I поєднані в один комплекс з білком S, який забезпечує зв’язок всього комплексу (К) з сайтом впізнавання, якщо сайт неметильований. Як і всі сайти впізнавання  ферментів цього класу, EcоK-сайт несиметричний:

5?-AACNNNNNNGTGC-3?

 3?-TTGNNNNNNCACG-5? .

В процесі гідролізу ферментний комплекс R2M2S  залишається зв’язаним із сайтом впізнавання.  Субодиниці комплексу кодуються генами hsdR, hsdM та  hsdS. Для запобігання деградації чужорідної ДНК її вводять, як правило, тільки у клітини, мутантні за геном  hsdR.

  Рестриктази  класу II     складаються з двох окремих білків: рестриктуючої ендонуклеази та модифікуючої метилази. Вони діють незалежно, що дуже зручно при експериментальних дослідженнях.  У рестриктаз класу   ІІ сайти розщеплення співпадають з сайтами пізнавання або знаходяться поряд з ними на строго визначеній відстані, що дозволяє отримувати фрагменти рестрикції визначеної довжини.  З цієї причини  рестриктази класу  ІІ на відміну від рестриктаз інших класів широко використовуються у генетичній інженерії. Найбільш важливі характеристики цих рестриктаз – структура їхніх сайтів впізнавання  та спосіб розщеплення ДНК. Вже відомо більше 500 рестриктаз типу II.   За структурою сайтів впізнавання  рестриктази класу ІІ поділяють на наступні підкласи.

Підклас ІІP представлений ферментами, які впізнають тетра-, гекса- та октануклеотидні послідовності з обертальної симетрією другого порядку (паліндроми). Рестриктази цього підкласу діють або на певні сайти, наприклад, TaqI-сайт

5?-TCGA-3?

 3?-AGCT-5?,

або на сайти, в яких присутні альтернативні основи, що займають симетричні позиції. Наприклад, по чотири сайти впізнавання мають рестриктази HaeI і HaeII:

5?-(A/T)GGCC(A/T)-3?

3?-(T/A)CCGG(T/A)-5?

та

5?-PuGCGCPy-3?

 3?-PyCGCGPu-5?,

відповідно, де   Pu – пурин,   Py – піримідин.

     Підклас ІІW пізнають пента- та гептануклеотидні паліндроми, в центрі яких знаходиться один з двох альтернативних нуклеотидів або будь-який нуклеотид (N). Фланкуючі нуклеотиди у симетричних положеннях також можуть бути альтернативними. Наприклад, HinfI-сайт:

5?-GANTC-3?

 3?-CTNAG-5?,

або DraI-сайт:

5?-PuGGNCCPy-3?

 3?-PyCCNGGPu-5?.

     Підклас  ІІN  представлений рестриктазами, які впізнають паліндроми, що перериваються декількома  довільними нуклеотидами, наприклад SfiI-сайт:

 

 5?-GGCCN5GGCC-3?

    3?-CCGGN5CCGG-5? .

     Рестриктази підкласів ІІS  та  ІІT  впізнають непаліндромні послідовності з 4-6 і більше пар нуклеотидів. Ці підкласи відрізняються тим, що у першому випадку рестриктази розщеплюють ДНК на визначеній відстані від сайта впізнавання  (1-20 п.н.), а у другому  – у самому сайті. Прикладом такої послідовності для підкласу ІІS може слугувати MnlI-сайт:

5?-CCTCN7-3?,

а для підкласу ІІT – SgrAI-сайт:

 

5?-CAG?CCGGTCG-3?.

     За способом  розщеплення ДНК рестриктази класу ІІ  розділяються на два типи.   Рестриктази першого типу здійснюють ступінчасте розрізання ниток ДНК, коли положення  зв’язків, що гідролізуються на різних нитках, не співпадають. В результаті  у фрагментів ДНК утворюються  одноланцюгові “липкі” кінці. Всі рестриктази підкласу ІІP  утворюють фрагменти рестрикції з липкими кінцями. Прикладом цього типу рестриктаз є згадана вище ендонуклеаза  EcоRI, яка формує 5?-одноланцюгові кінці. Виступати можуть і 3?-кінці як, наприклад, при дії рестриктази PstI:

 

5?-NNNCTGCA?GNNN-3?

 3?-NNNG?ACGTCNNN-5?.

?PstI:

 5?-NNNCTGCA-3?                               5?-GNNN-3?

                        3?-NNNG-5?                               3?-ACGTCNNN-5?.

 

Рестриктази другого типу  виконують розрізи в співпадаючих зв’язках і утворюють тупі кінці.

Приклад дії  рестриктаз другого типу:

 

5?-NNNCСС?GGGNNN-3?

3?-NNNGGG?CCCNNN-5?

?SmaI:

5?-NNNCСС-3?                5?-GGGNNN-3?

  3?-NNNGGG-5?               3?-  CCCNNN-5?.

     У двох останніх  прикладах сайти розщеплення співпадають із сайтами впізнавання.  Саме такі сайти і дістали назву сайтів рестрикції. Коли  вони представлені паліндромами, то на різних ланцюгах ДНК гідролізуються зв’язки, розташовані або  симетрично відносно центру паліндрому, або в самому центрі. Це дозволяє  попередні приклади записати у короткій формі:  5?-CTGCA?G-3? та 5?-CCC?GGG-3?, причому  знаки 5? і 3? можуть опускатися. Знак ? вказує на розташування  зв’язків, які гідролізуються,  що  визначає кількість нуклеотидних ланок на кінцях, що виступають.

Для рестриктаз, які впізнають непаліндромні послідовності нуклеотидів і розщеплюють  ДНК в  стороні від сайтів впізнавання, в коротких записах вказують у скобках для кожного ланцюга відстані від них до  зв’язків, що гідролізуються.  Наприклад, рестриктазу HgaI характеризує запис GACGC(5/10).  Він  розшифровується наступним чином:

 

5?-NNGACGCNNNNN?NNNNNNN-3?

3?-NNCTGCGNNNNNNNNNN?NN-5?

?HgaI:

 5?-NNGACGCNNNNN-3?

                3?-NNCTGCGNNNNNNNNNN-5?.

     Багато рестриктаз, навіть виділених з бактерій  різних родин, впізнають на ДНК однакові сайти. Такі рестриктази  називають ізомерами. Вони  розділяються на ізошизомери  та гетерошизомери.  Перші не тільки впізнають однакові сайти, але і однаково їх розщеплюють. Прикладом ізошизомерів є рестриктази BspRI, BsuRI, CltI, FnuDI, які мають єдиний сайт впізнавання GG?CC. Гетерошизомерами є, наприклад, рестриктази Asp718I (5?-G?GTACC-3?) та KpnI (5?-GGTAC?C-3?).  Деякі рестриктази характеризуються великою кількістю ізомерів. Так, для BamHI  знайдено 20 ізомерів, з них 4 ізошизомери.

Рестрикти, які мають однакові липкі кінці за рахунок дії однієї і тієї ж рестриктази або її ізошизомерів, здатні поєднуватися один з одним з відновленням  сайту рестрикції між ними. Але однакові липкі кінці можуть утворитися і при дії на ДНК рестриктаз, які впізнають різні сайти. До таких ферментів відносяться, наприклад,  рестриктази BamHI (5?-G?GATCC-3?), BglII  (5?-A?GATCT-3?), BclI  (5?-T?GATCA-3?), XhoII  (5?-Pu?GATCPy-3?) і MboI  (5?-?GATC-3?). Нуклеотидні залишки, які формують липкі кінці, тут підкреслені. Об’єднуватися у даному випадку будуть будь-які рестрикти, але відновлені між ними сайти будуть впізнаватися тільки рестриктазою MboI.

Рестриктази класу III, як і рестриктази класу І,   діють в одному комплексі  з метилазами і впізнають несиметричні послідовності нуклеотидів. Комплекс складається з двох субодиниць. Здатність  до специфічного зв’язування з ДНК притаманна тільки  метилазі, тому її називають MS-субодиницею. Розщеплення ДНК  R-субодиницями  відбувається на визначеній відстані від сайтів впізнавання. Наприклад, рестриктаза EcoP1 характеризується сайтом AGACC (27/25). Рестриктази цього класу ще називають “лінивими”, оскільки вони  забезпечують гідроліз у  всіх сайтах.

     Рестриктази класу IV представлені поки що унікальним ферментом Eco571,  в одному поліпептичному ланцюгу якого  присутні обидва типи активності – ендонуклеазна та метилазна. Фермент характеризується сайтом CTGAAG (16/14).

Всі рестриктази також поділяють на дрібноріжучі (впізнають сайти з чотирьох нуклеотидів) та крупноріжучі ( впізнають сайти з шести нуклеотидів).  При випадковому розподіленні нуклеотидів в ДНК та однаковій зустрічаємості AT- та  GC-пар ділянки, що складаються з чотирьох певних нуклеотидів, зустрічаються у середньому через 44=256 нуклеотидних залишків,  ділянки з шести нуклеотидів – через 46=4096 нуклеотидних залишків,  ділянки з  n-нуклеотидів – через 4n нуклеотидні залишки. Виходячи з цього,  кількість сайтів впізнавання  на один геном або ген відомої довжини до деякої міри можна прогнозувати. Більш точний прогноз можливо зробити, оцінивши у сайті впізнавання і в піддослідній ДНК  вміст  AT- та  GC-пар. Якщо сайт рестрикції виявиться у середині гена, то обробка рестриктазою приведе до його інактивації. Вірогідність цієї події дуже велика  при використанні дрібноріжучих рестриктаз і значно менша при використанні крупноріжучих рестриктаз.  З метою отримання неушкодженого гена  розщеплення ДНК здійснюють, обробляючи її послідовно декількома крупноріжучими рестриктазами або ж використовують прийом  “недорестрикції”, тобто рестрикцію здійснюють в таких умовах, за яких розщеплення відбувається  лише в одному сайті з декількох можливих.

В генетичній інженерії використовуються  виключно рестриктази класу II.  Найбільш цінними є рестриктази, які утворюють липкі кінці.  Деякі з них представлені в таблиці

restrictase_2

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.