ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Поєднання донорної та векторної ДНК з утворенням рекомбінантної ДНК

Зазвичай,  при одержанні донорної вставки та вектора геномна ДНК та плазмідна ДНК розрізаються одним і тим самим ферментом рестрикції, який продукує комплементарні “липкі” кінці. Найбільш простий і доступний метод з'єднання фрагментів ДНК – це віджиг фрагментів, отриманих після обробки ДНК тією рестриктазою, що утворює "липкі" комплементарні однониткові кінці.

dnk-ligazaВ результаті віджигу комплементарні кінці двох фрагментів  - донорної та векторної ДНК -  з'єднуються водневими зв'язками. Ковалентні 3', 5'-фосфодіефірні зв'язки між фрагментами утворюються ферментом ДНК-лігазою. ДНК-лігаза відновлює ковалентну безперервність ланцюгів ДНК.  Фрагменти донорної та векторної ДНК змішують in vitro за відповідних фізіологічних умов, їх “липкі” кінці поєднуються, в результаті чого формуються рекомбінантні молекули ДНК.

ДНК-лігази відкриті в 1967 році. Добре вивчені ДНК-лігази бактеріофага Т-4 та Е. соlі.   Ці ферменти найбільш ефективно з'єднують фрагменти ДНК з "липкими" кінцями. Однак, наявність "липких" кінців не є обов'язковою умовою для з’єднання фрагментів ДНК-лігазою. ДНК-лігаза фага Т-4 здатна з'єднувати і тупі двониткові фрагменти ДНК. Але, щоб ця реакція  відбувалася ефективно, необхідна висока концентрація ДНК та  значно більші (приблизно в 10 разів) концентрації ферменту. Цей процес прискорюється також,  якщо в інкубаційне середовище крім ДНК-лігази  додають  РНК-лігазу фага Т-4.

Досить часто виникає необхідність з'єднати фрагмент ДНК, отриманий шляхом розщеплення однією рестриктазою, з вектором, який має сайт рестрикції, специфічний до іншої рестриктази. Щоб з'єднати два, отримані різними рестриктазами фрагменти ДНК з некомплементарними кінцями, використовують короткі синтетичні дволанцюгові олігонуклеотиди, які  мають у своєму складі сайти впізнання необхідними рестриктазами. Такі олігонуклеотиди називають лінкерами. Лінкер повинен мати "липкі" кінці до обох фрагментів ДНК, які необхідно з'єднати,   і утворює з ними водневі зв'язки.  Далі лігаза каталізує утворення ковалентних міжнуклеотидних зв'язків між лінкером та фрагментами ДНК.

Якщо у якості донорної взято комплементарну ДНК (кДНК), яка не містить “липких” кінців, поєднання донора і вектора  відбувається тільки за допомогою ДНК-лігази або до кожного кінця  вектора і кДНК додаються “липкі” кінці.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.