ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Отримання трансгенних ссавців

Загальна схема отримання трансгенних ссавців у теперішній  час добре розроблена.  Вона відбувається шляхом мікроін’єкції  сторонньої ДНК у яйцеклітини або ранні  ембріони.    А. И. Божков (2008) виділяє  наступні  стадії введення  розчину рекомбінантної ДНК та отримання трансгенних ссавців:

а) підготовка тварини та видалення яйцеклітин або ембріонів;

б)  мікроін’єкція сторонньої ДНК в пронуклеус;

в) пересадка ін’єктованих ембріонів до яйцеводів (якщо використовується проміжне культивування) або  в матку синхронізованих сурогатних матерів;

г)  народження трансгенних тварин;

д) скринінг   потомства на наявність трансгена.mikroinekciya

Для  трансформації тварин шляхом мікроін’єкції   використовують   запліднені яйцеклітини на стадії двох пронуклеусів або двоклітинні ембріони.  Тільки в такому разі можна отримати тварин, у яких і в генеративних, і в соматичних клітинах  міститися  трансгени.

Для тварин відомо, що рекомбінантні молекули ДНК в лінійній формі     інтегрують трансген до  ДНК  реципієнта в кілька разів краще, ніж  кільцеві молекули ДНК.    Вбудовування  векторних послідовностей ДНК  разом з трансгеном знижує  інтенсивність його експресії в 1000 разів. З цієї причини  за допомогою специфічних рестриктаз кільцеві молекули ДНК переводять в лінійну  форму   та видаляють векторні     послідовності.

Концентрація розчину  ДНК для мікроін’єкцій     повинна складати 1-2 пг ДНК/мл. Це відповідає 200-400 копіям ДНК, якщо одна копія містить 5000 пар нуклеотидів (розмір середнього гена). За дотримання таких умов  частота інтеграції ДНК в геном складає 20-40%. ДНК, введена до пронуклеусу шляхом мікроін’єкції, інтегрується  лише в один сайт у вигляді тандемних послідовностей.

Для отримання запліднених яйцеклітин  перед  обробкою їх розчином рекомбінантної ДНК використовують суперовуляцію. У теперішній час розроблені окремі схеми гормональної стимуляції суперовуляції, штучного запліднення та вимивання ембріонів для основних видів сільськогосподарських тварин.

Мікроін’єкції ДНК в запліднені яйцеклітини та ембріони  проводять за обов’язкової візуалізації  з використанням   інвертованих або прямих мікроскопів з диференціальною  інтерференційно-контрастною оптикою, яка

забезпечує  достатнє розрішення мембран пронуклеусу. Мікроін’єкції проводять  скляними  ін’єкційними  голками, які  відтягують на  мікроковальні  у той же самий день.   Скляні ін’єкційні голки виробляють зі стандартних  товстостінних капілярів боросилікатного скла, зовнішній діаметр яких складає 1,0 мм, а внутрішній – 0,58 мм, кінчик повинен бути не менш 1 мкм.  Мікроін’єкції проводять у краплях  забуференого розчину Дульбекко.  Наносять  серію крапель  діаметром  1,5 мм. Одна крапля представляє собою  розчин ДНК для  ін’єкцій.  В підготовлені краплі  пастерівською піпеткою  вносять по  дві запліднені яйцеклітини.

Запліднені яйцеклітини від суперовульованих спарених самиць культивують  протягом 1 години в середовищі М16 з 10 % бичачим сироваточним  альбуміном  при 370 С и 5 % СО2 у повітрі.  Відбирають  яйцеклітини з пронуклеусами і переносять їх в краплину середовища РВ1. В мікрокапіляр  набирають  розчин ДНК з першої краплі. За допомогою маніпулятора  орієнтують яйця  так, щоб  обидва пронулеуси були в фокусі. Чоловічий пронуклеус має більший розмір, ніж жіночий. Яйце утримують  піпеткою, приклавши до спеціального шприцу від’ємний тиск.  Капіляр вводять у чоловічий пронуклеус коротким різким уколом, щоб проколоти мембрану.  Після введення розчину ДНК пронуклеус повинен збільшитися в об’ємі, пізніше він  зменшиться до звичайних розмірів. Мікрокапіляр виводять з яйця.  Після цього прооперовані яйця  промивають   6-тю краплями середовища М16, яке містить 10 % бичачий  сироваточний альбумін, і лишають  на ніч  у краплині М16 з 10 %  бичачим  сироваточним альбуміном  при 370 С и 5 % СО2 у повітрі.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.