ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Дослідження біотехнології

Загалом генна інженерія дає змогу не тільки синтезувати білки, що становлять інтерес як такі, а і вводити в живу клітину особливі ферменти, регуляторні й будь-які інші білки. У такий спосіб можна надати клітині цілком нової ферментативної, регуляторної або транспортної активності, знайти яку серед нативних організмів або отримати випадковим мутагенезом було б досить маловірогідно.

Зброджування субстрату у виробництві етанолу здійснюють, в основному, за участю Saccharomyces cerevisiae, але замість нього часто використовують бактерію Zymomonas mobilis, так як ця  паличка  зброджує глюкозу, фруктозу і сахарозу з відносно великим виходом  етанолу.  У Z. mobilis  також вища швидкість синтезу етанолу.  До геному  Z. mobilis  були встроєні і експресовані  деякі сторонні гени, відповідальні за розширення спектру субстратів, що утилізуються, зокрема,  були введені гени глюкозо-ксилозоізомерази і ксилулокинази, необхідні для утилізації ксилози.   До  клітин Z. mobilis  була введена плазміда, що несла два синтетичні оперони, один з яких кодував два ферменти розщеплення ксилози, а інший – два ферменти утилізації  пентози (транскетолазу і трансальдолазу).  Ці два синтетичні оперони були встроєні у човниковий вектор E.coli - Z. mobilis, яким і була  трансформована бактерія  Z. mobilis.  Трансформовані клітини утилізували ксилозу і перетворювали пентози до фруктозо-6-фосфата і гліцеральдегід-3-фосфата, які потім перетворювалися на  етанол. Трансформанти ефективно зростали на глюкозі, ксилозі і їх суміші і перетворювали ксилозу в етанол з великим виходом.  Дана робота відкриває перспективи для використання  при виробництві етанолу  як джерела вуглецю ксилози, яка є  побічним продуктом деревообробної та целюлозно-паперової промисловості.

Використовуючи технологію рекомбінантних ДНК можна спрямовано змінювати метаболізм мікроорганізмів, вводячи у них нові гени або модифікуючи вже існуючі. Головною метою таких змін є створення рекомбінантних мікроорганізмів з новою ферментативною активністю, здатних перетворювати існуючий субстрат на цінний продукт, звичайно отримуваний тільки поєднанням хімічних і мікробіологічних методів. Саме  такий напрямок досліджень представляють біотехнології отримання цінних низькомолекулярних сполук. Прикладом   може бути синтез за допомогою рекомбінантних мікроорганізмів L-аскорбінової кислоти (вітаміну С).

Нині для промислового виробництва L-аскорбінової кислоти використовують переважно трудомісткий процес, що охоплює одну мікробіологічну і кілька хімічних стадій. Вихідним субстратом для нього  є D-глюкоза. На останньому етапі  виробництва  2-кето-L-гулонова кислота (2-KLG) перетворюється у кислих умовах на L-аскорбінову кислоту. Біохімічні дослідження метаболізму різних бактерій показали, що 2-KLG не синтезується прямо з глюкози. Так, одні бактерії (Acetobacter, Gluconobacter та Erwinia) можуть перетворювати глюкозу на 2,5-дикето-D-глюконову кислоту (2,5-DKG), а інші (Corynebacterium, Brevibacterium та Arthrobacter), які синтезують фермент 2,5-DКG-редуктазу, – перетворювати 2,5-DKG на 2-KLG.

З метою поєднання всіх стадій утворення 2-KLG у метаболізмі одного рекомбінантного мікроорганізму було виділено ген 2,5-DKG-редуктази Corynebacterium sp. і перенесено в Erwinia herbicola. Першими етапами на цьому шляху були виділення і очищення 2,5-DKG-редуктази Corynebacterium sp. і визначення послідовності її перших 40 N-амінокислот. Виходячи з цих даних були синтезовані два 43-нуклеотидні гібридизаційні зонди, які відповідали різним частинам білкової молекули. Синтезовані зонди використовували далі для скринінгу банку клонів ДНК Corynebacterium. У такий спосіб виділили клон, що містив ген 2,5-DKG-peдyктази, і далі секвенували цей ген. Нуклеотидні послідовності, розміщені до стартового кодону ATG, вирізали і замінювали їх на сигнали транскрипції та трансляції, що функціонують у Е.соlі, оскільки регуляторні послідовності грампозитивних мікроорганізмів типу Corynebacterium  не функціонують у клітинах  кишкової палички. Отриману конструкцію далі вводили у Е.соlі (при цьому синтезувалася активна 2,5-DKG-peдyктаза), а потім переклоновували у векторі з широким колом хазяїв і трансформували їм   Erwinia herbicola.

Трансформовані клітини Erwinia   активно перетворювали D-глюкозу безпосередньо на 2,5-KLG, при цьому власні ферменти Erwinia, локалізовані у внутрішній мембрані бактерійної клітини, активно перетворювали глюкозу на 2,5-DKG, а 2,5-DKG-редуктаза, локалізована в цитоплазмі, каталізувала подальше перетворення 2,5-DKG на 2,5-KLG. Отже, за допомогою генно-інженерних маніпуляцій метаболічні реакції, що проходять у таких різних мікроорганізмах, вдалося здійснити в одному з них.

Ще один приклад застосування рекомбінантних мікроорганізмів для отримання цінних низькомолекулярних сполук – отримання з їх допомогою барвника індиго. Відомо, що багато бактерій, особливо роду  Pseudomonas, здатні утилізувати різні органічні сполуки типу нафталіну, толуолу, ксилолу і фенолу, які є для них єдиним джерелом вуглецю. Дуже часто гени ферментів, що каталізують розщеплення цих органічних сполук, розміщуються у великих природних плазмідах (завдовжки 20–50 тис.п.н). При дослідженні одного з трансформантів, отриманих введенням до клітин Е.соlі однієї з таких плазмід (яка до того ж містила вставку  довжиною 10,5 тис.п.н.), здатного внаслідок цього перетворювати нафталін на саліцилову кислоту, виявилося, що мінімальне ростове середовище, яке містить триптофан, набуває синього забарвлення. Аналіз показав, що трансформовані клітини Е.соlі синтезували барвник індиго.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.