ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Добір клонів рекомбінантних ДНК

 Індивідуальний клон рекомбінантної ДНК представляє лише невелику частку геному донорного організму або тільки одну із тисяч мРНК, які синтезує донорний організм. Зазвичай, започатковують колекцію усіх сегментів ДНК геному, які можливо отримати за дії ферментів рестрикції. Зокрема, всю геномну ДНК розділяють на сегменти, розміри яких визначаються конкретним вектором для клонування, і вставляють кожний у різні копії вектора, створюючи тим самим колекцію рекомбінантних молекул ДНК. Взяті усі разом вони представляють цілий геном. Потім ці молекули шляхом трансформації або трансдукції вводять в окремі реципієнтні клітини бактерій, де вони ампліфікуються. Така колекція клітин бактерій або бактеріофагів, які несуть рекомбінантні ДНК, називається геномною бібліотекою.

dobir_klonivЯкщо використовується вектор для клонування, який акцептує вставку у середньому 10 тис.п.н. і якщо весь досліджуваний геном має довжину 100000 тис.п.н., що відповідає розміру генома нематоди Caenorhabditis elegans, весь геном буде представлений 100000 тис.п.н. : 10 тис.п.н. = 10000 окремих рекомбінантних клонів ДНК. Для впевненості у тому, що всі нуклеотидні послідовності геному представлені у колекції, геномні бібліотеки створюють таким чином, щоб кожний сегмент геному був  повторений до 5 разів.   Тотальне клонування всіх  виділених фрагментів ДНК також називається шот-ган (shot-gun) – експериментом.

Подібну колекцію можна сформувати із кДНК вставок і називатися така колекція буде кДНК-бібліотекою. Ця бібліотека буде представляти не весь геном, а лише райони геному, що кодують білки. Для побудови вичерпної кДНК-бібліотеки використовують зразки мРНК з різних тканин, різних стадій розвитку та організмів, які сформувалися у різних умовах навколишнього середовища.

Вибір того, чи проводимо ми конструювання геномної бібліотеки чи   кДНК-бібліотеки залежить від  типу донорної ДНК. Якщо ми шукаємо специфічний ген, який є активним у специфічному типі тканини рослини або  тварини, треба звернутися до конструювання кДНК-бібліотеки зі зразка цієї тканини. Наприклад, найбільш придатним джерелом для ідентифікації кДНК, які відповідають інсуліновим мРНК людини, і створення відповідної кДНК-бібліотеки будуть численні мРНК з панкреатичних клітин.  Оскільки кДНК-бібліотека представляє піднабір транскрибованих ділянок геному, вона буде коротшою, ніж повна геномна бібліотека. Переваги геномних бібліотек полягають у тому, що вони містять гени у їх первісному вигляді, з інтронами та регуляторними  послідовностями, що не транскрибуються.

 У випадку конструювання рекомбінантної ДНК, яка вміщує визначений ген з деякими відомими характеристиками, фрагменти ДНК, які одержують під дією рестриктаз, розділяють за допомогою електрофорезу у агарозному або поліакріламідному гелі. Бібліотеки генів вміщують значну кількість фрагментів, серед яких є і конкретний ген, який цікавить дослідника. Наступною задачею е ідентифікація конкретного клону у бібліотеці, який несе  бажаний ген.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.