ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Біотехнологія інтерферону.

Інтерферони були відкриті в 1957 році у Національному інституті медичних досліджень у Лондоні. Було встановлено, що коли в організмі з'являються клітини, інфіковані вірусом, то у ньому утворюється фактор, здатний надавати інтактним клітинам стійкість до вірусної інфекції. Цей фактор перешкоджає (інтерферує) подальшому розмноженню вірусів в клітинах, а тому отримав назву інтерферон. Здатність утворювати інтерферони – важливий спосіб захисту організму від інфекції.klonirov_iterferona

Інтерферони – видоспецифічні білки, які складаються з 146-166 амінокислотних залишків.  Розрізняють три групи інтерферонів.

?-інтерферони (?-І) утворюються за дії вірусів на лейкоцити. Родина ?-інтерферонів представлена простими білками, молекули яких мають два дисульфідних містки, кодується приблизно 20 генами.

?-інтерферони (?-І) з'являються за дії вірусів на фібробласти. Це   глікопротеїди,  число генів, що їх кодує  не встановлено.

?-інтерферони (?-І) виробляються Т-лімфоцитами, за умови, коли в організмі існують спеціальні Т-клітини на певні вірусні антигени. ?-інтерферон представлений в організмі людини одним глікопротеїдом.

Інтерферони знайшли широке використання для лікування різних важких хвороб – гострого вірусного гепатиту, розсіяного склерозу, остеосаркоми, мієломи, лімфоми, меланоми, пухлин гортані, легень, мозку.

Механізм дії інтерферону   полягає у тому, що інтерферон взаємодіє з клітинними рецепторами і ініціює транскрипцію двох структурних генів -  2', 5'-олігоаденілатситетази і протеїнкінази. Обидва ферменти проявляють свою активність у присутності дволанцюгових ДНК, які є продуктами реплікації вірусів. Фермент 2',5'-олігоаденілатситетаза каталізує синтез 2',5'-олігоаденілатів з АТФ. Останні активують рибонуклеазу І, яка здійснює деградацію мРНК та рРНК. Активована протеїнкіназа фосфорилює один із трьох факторів ініціації трансляції, IF2. Ці процеси призводять до інгібування як біосинтезу білка, так і розмноження вірусів в інфікованій клітині.

Для застосування у медицині потрібен людський інтерферон, оскільки він є видоспецифічним. Інтерферон отримують з крові людини (з 1 л крові можна виділити 1 мкг інтерферону, тобто приблизно, одну дозу для ін'єкції).

Виробництво ?-інтерферону з крові налагодила Фінляндія, а пізніше – Франція. З 1980 року в Японії розпочали виробництво інтерферонів за допомогою культури клітин лімфобластів. Синтез інтерферону індукували інфікуванням лімфобластів вірусом седней. Лімфобласти культивували у ферментерах. Інтерферон виділяли за допомогою афінної хроматографії з використанням моноклональних антитіл. У Швеції налагоджено виробництво лімфобластичного інтерферону у ферментерах об'ємом 200 л. В Англії був розроблений метод отримання ?-інтерферону з фібробластів, виділених з тканин плода. Такі клітини можна підтримувати у культурі клітин, що відкриває можливість масового виробництва ?-інтерферону.

Перераховані методи отримання інтерферонів з клітин людини характеризуються низьким виходом продукту, високою вартістю та недостатньою чистотою препарату. На сучасному етапі найбільш перспективним методом є біосинтез інтерферонів за допомогою генетично сконструйованих мікроорганізмів. Розробка генно-інженерної технології отримання інтерферонів була пов'язана з подоланням ряду труднощів. Шляхом зворотної транскрипції отримана кДНК інтерферону, незважаючи на те, що в суміші мРНК клітини доля мРНК інтерферону складає не більше 0,1%. Ген інтерферону був вбудований у векторну ДНК разом з бактеріальними регуляторними елементами, які забезпечують транскрипцію і трансляцію у бактеріальній клітині.

Виявилося, що в клітинах людини інтерферони синтезуються у вигляді попередників, які містять на N – кінці сигнальний пептид. В результаті специфічного протеолізу відбувається дозрівання попередника у зрілий інтерферон. У разі клонування гена інтерферону у Е. соlі бактеріальна клітина не містить ферментів, здатних відщепити сигнальний пептид і утворити зрілий інтерферон. У зв'язку з цим, щоб забезпечити синтез зрілого інтерферону у бактеріальній клітині, потрібно було від його гена відщепити фрагмент, що кодує сигнальний пептид, а потрібну частину використати для генно-інженерного конструювання рекомбінантної ДНК. Щоб розщепити ген інтерферону, була використана рестриктаза Sau3A1, оскільки ген інтерферону містить три сайти розщеплення даною рестриктазою (один із сайтів розміщений поруч з сигнальною частиною). Неповний гідроліз гена цією рестриктазою дозволив виділити фрагмент гена, що кодує зрілий інтерферон, але без першого цистеїну. Триплет TGT, що кодує цистеїн, відщеплюється рестриктазою разом із сигнальним фрагментом. Для відновлення структури гена був синтезований хімічним шляхом невеликий фрагмент ДНК, який містив потрібний триплет, а також ініціюючий триплет ATG. Синтезований фрагмент ДНК був сполучений ДНК–лігазою з неповним геном інтерферону, отриманим за допомогою рестриктази Sau3A1, і  структура гена була повністю відновлена. Створений ген був з'єднаний з векторною ДНК таким чином, що він виявився розміщеним біля промотору, який забезпечив синтез мРНК інтерферону у трансформованих клітинах.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.