ХімТехДопомога

Допомога в питаннях, пов'язаних з хімічною промисловістю починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком

Аспекти генетичної інженерії окремих груп організмів

Поряд із загальними принципами побудови рекомбінантних ДНК  окремі групи живих істот -  бактерії, гриби, рослини, тварини, розрізняються за способами ефективного перенесення чужорідної (сторонньої) ДНК в  клітини реципієнта та  мають специфічні  вимоги  до будови окремих ділянок рекомбінантних ДНК для забезпечення  експресії трансгенів  у   відповідних організмів.  Ефективність перенесення та експресії транс генів певним чином  пов’язані з морфо-функциональною організацією, способами розмноження, стадіями життєвих циклів  реципієнтів і мають враховуватися при виконанні генно-інженерних маніпуляцій з конкретним видом живих істот.

genetuchna_ingeneriya

 ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ БАКТЕРІЙ

При  використанні плазмідних векторів для створення рекомбінантних ДНК останні вносяться в бактеріальні  клітини шляхом трансформації. Трансформація - це процес введення вільної ДНК в бактеріальну клітину. Найчастіше  при трансформації  рекомбінантними ДНК використовуються   клітини  Е.соlі. Щоб забезпечити трансформацію рекомбінантних ДНК в клітини  кишкової палички їх обробляють холодним розчином СаС12 і  витримують при 42°С протягом 1,5 хв.  За такої обробки здійснюється локальне порушення клітинної стінки, що й забезпечує  проникнення ДНК в клітини. Цей метод дає максимальну частоту трансформації, приблизно 10-3, тобто на кожну 1000 клітин приходиться одна трансформована. Ефективність трансформації, яка  визначається як число трансформантів на 1 мкг взятої для досліду ДНК,   складає приблизно 107-109/мкг ДНК.

Клітини, здатні поглинати чужорідну ДНК, називаються компетентними. Компетентність Е.соlі потрібно індукувати. Деякі інші бактерії мають постійну компетентність щодо чужорідної ДНК. Долю компетентних клітин можна підвищувати, якщо використовувати спеціальне  живильне  середовище чи  умови культивування. Зокрема, для підвищення компетентності бактерій, стійких до хімічних індукторів, використовують електропорацію. Збільшення проникності клітинних мембран досягають дією на них електричного струму. Умови електропорації розрізняються для різних видів бактерій. При роботі з Е.соlі клітинну суспензію і ДНК вносять у пробірку з електродом і подають одиничний імпульс струму тривалістю ~ 4,5мс. Після такої обробки ефективність трансформації підвищується до 109 для коротких плазмід (приблизно 3 тис.п.н.) і до 106 для великих плазмід (приблизно 100 тис.п.н.). Механізм проникнення ДНК шляхом електропорації не вивчений. Вважають, що як і за хімічної індукції трансформації в результаті електрошоку в клітинній стінці утворюються тимчасові  отвори, через які ДНК проникає в клітину.

Рекомбінантні ДНК, побудовані на основі фагових векторів, проникають у клітини шляхом трансфекції. Більш ефективно передача фагових геномів досягається в тому випадку, коли вони попередньо упаковуються у фагові голівки in vitro, а потім вводяться в клітину за допомогою стандартної процедури інфікування. Дуже важливою вимогою у цьому випадку є здатність клітин адсорбувати і реплікувати бактеріофаг.

Генетична інженерія  бактерій використовується для отримання як бактеріальних, так і  еукаріотичних продуктів. До теперішнього часу не склалося чіткого уявлення про механізм впливу локальної структури ДНК на ефективність транскрипції генів. Не з’ясовані  до   кінця також причини нестабільності векторів і рекомбінантних ДНК в реціпієнтних клітинах. Часто нестабільним у бактеріальних клітинах є і сам чужорідний білок.  Встановлено, що склад кодонів еукаріотичних генів не є оптимальним для їх експресії в бактеріальних клітинах. У зв’язку з цим приймаються заходи з оптимізації експресії чужорідних генів, тобто  підбираються  придатні промотори, оператори, термінатори транскрипції, сайти зв’язування рибосом, фізіологічні  та інші умови. Добре налагоджена система експресії приводить до створення суперпродуцентів, в яких вихід чужорідного продукту може досягати 10-40% від сумарного білка. Найважливішими завданнями при культивуванні суперпродуцентів є підтримання  їх стабільності і забезпечення секреції синтезованих ними продуктів.

Експресія генів є складним багатоетапним процесом, який залежить від багатьох факторів,  що впливають   на нього  на різних рівнях – на рівні ДНК, мРНК  або білка.

На рівні ДНК ефективність експресії залежить від сили промотору, наявності термінатора транскрипції, відсутності  внутрішньогенних термінаторів транскрипції, кількості копій гена, суперспіралізації рекомбінантної ДНК, від розташування  чужорідного гена   відносно  напряму руху реплікативної вилки.

На рівні РНК ефективність експресії чужорідного гена залежить від структури сайта зв’язування рибосом, стабільності транскрипта, наявності в мРНК оптимальних кодонів.

На рівні білка ефективність експресії залежить від стабільності поліпептида, його внутрішньоклітинної агрегації, можливості правильної модифікації чужорідного білка, включаючи його процесінг  та   здатність до секреції.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ХімТехДопомога © 2015 Сайт присвячений хімічній промисловості, починаючи від важкого машинобудування і закінчуючи поліграфією та друком. Детальні огляди можливостей промислових досягнень. На сайті згадуються такі теми як: протикорозійний захист, методи другу видавничої продукції, технології виробництва термопластів, додрукарська підготовка видання та багато іншого.